Sitohistoteknologi

 Sitohistoteknologi

NAMA                     : VALANTINE WAAS

NIM                          : 18 3145353 112

KELAS                     : 2018 C

"PEMERIKSAAN SITOHISTOTEKNOLOGI"

    Sitohistoteknologi merupakan ilmu yang mempelajari tentang preparasi sel-sel dan jaringan tubuh sampai menjadi sediaan mikroskopis yang digunakan untuk mendiagnosa adanya kelainan-kelainan dalam tubuh

    Sitohistoteknologi terdiri dari : Sito berarti sel dan Histo berarti jaringan. Jadi merupakan ilmu yang mempelajari tentang sel dan jaringan.  Dalam jaringan pada umumnya terdapat 3 komponen dasar yang menyusunnya yaitu : Sel , Substansi Interseluler dan Cairan.

    Diagnosa histopatologi, sampai saat ini masih merupakan kunci dalam diagnosa sebagian besar penyakit. Diagnosa penyakit secara histologi dan sitologi dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Untuk mendapatkan sediaan mikroskopis diperlukan metode pewarnaan tertentu. Ada beberapa teknik pewarnaan yang dilakukan di laboratorium Sitohistoteknologi, antara lain: pewarnaan Hematoksilin Eosin, pewarnaan Papanicolaou, pewarnaan khusus imunohistokimia, dll. Laboratorium ini memiliki kekhasan dibandingkan laboratorium kesehatan lainnya. Hal ini terlihat dari instrumen dan reagen yang berbeda dan spesifik.

1.    Sel

Merupakan komponen yang bersifat hidup dalam jaringan dan merupakan unit struktural dan fungsional yang terkecil dari organisme.

2.   Substansi Interseluler

Bersifat tidak hidup dan sebagai hasil produksi sel. Terdapat diantara sel-sel didalam jaringan. Bentuk fisiknya dapat dipilahkan :

a.   Sebagai substansi dasar karena tidak berbentuk dan dalam keadaan setengah padat.

b.   Sebagai serabut.

3.   Cairan

Merupakan komponen yang menonjol dalam plasma darah, cairan limfa, cairan jaringan

 

    Menurut PERMENKES RI Nomor 411/MENKES/PER/III/2010 menyebutkan bahwa Laboratorium patologi anatomik merupakan laboratorium yang melaksanakan pembuatan preparat histopatologi, pulasan khusus sederhana, pembuatan preparat sitologik, dan pembuatan preparat dengan teknik potong beku. Pelayanan laboratorium Patologi Anatomik menerima spesimen berupa jaringan dan/atau cairan tubuh yang didapat dari tubuh pasien dan bermakna klinis bagi diagnosis suatu penyakit. Pelayanan laboratorium patologi anatomikberperan sebagai baku emas dalam penegakkan diagnosis yang berbasis perubahan morfologi sel dan jaringan sampai pemeriksaan imunologik dan molekuler khusus yang bersumber dari sel maupun jaringan. Patologianatomik berperan dalam mendeteksi kelainan akibat perubahan pada jaringan tubuh dan melakukan penapisan dari suatu penyakit.Peran laboratorium Patologi Anatomik semakin meluas mencakup penentuan pilihan terapi dan prediksi prognosis yang sejalan dengan perkembangan ilmu dan teknologi.

    Di dalam laboratorium patologi anatomik ada dua komponen besar dalam pelayanan laboratorium. Dua komponen besar tersebut adalah laboratorium histopatologi dan laboratorium sitopatologi. Laboratorium histopatologi merupakan laboratorium yang menangani spesimen berupa jaringan sedangkan laboratorium sitopatologi menangani spesimen berupa cairan atau bentukan lain yang mengandung sel-sel untuk dilakukan diagnosis. Kedua laboratorium tersebut dapat berkolaborasi menjadi satu ketika spesimen berupa materi mengandung sel namun diperlakukan seperti sebuah jaringan atau organ (cytoblock/sitoblok).

    Spesimen yang diterima untuk pemeriksaan spesimen sitologik maupun spesimen histopatologi tercantum dalam Tabel 1 Spesimen sitologik diambil dengan tujuan jaringan memeriksa pada tingkat sel. Spesimen sitologik didapat dari sel yang terlepas (exfoliatif) atau sel yang terlepas dari jaringan. Jenis spesimen yang paling umum yang diterima di laboratorium patologi anatomik adalah spesimen cervical Pap Smear, hal ini dikarenakan Pap Smear merupakan salah satu program pemerintah dalam menurunkan angka kanker servik. Selain itu spesimen yang diterima di laboratorium sitologi adalah spesimen sitologi aspirasi jarum halus (FNA (Fine Needle Aspiration), dimana sel didapatkan dari jarum yang sangat tipis yang dimasukkan ke sebuah lesi berbentuk cairan (misalnya kista tiroid). Selain itu spesimen dapat berasal dari urin, dahak, cairan cerebrospinal, cairan berasal dari bilasandan lain sebagainya yang mengandung materi sel. Lain halnya dengan spesimen untuk laboratorium histopatologi, dimana spesimen untuk laboratorium histopatologi adalah seluruh organ yang diambil dari pasien baik berukuran kecil maupun berukuran besar.

                   Tabel 1 Spesimen Umum Laboratorium Sitologi dan Histologi

Sitologi	Histologi
Goresan Sel	Biopsi Jarum
Aspirasi Sel	Biopsi Endoskopi
Cairan Tubuh	Biopsi Eksisi

 adapun  alur kerja laboratorium Sitologi dan Histologi dibawah ini 

                                Gambar 1 Alur Kerja Laboratorium Sitologi

                        Gambar 2 Alur Kerja Laboratorium Histologi.

A.    A. Teknik Sediaan Histologik

            Histopatologi adalah prosedur yang melibatkan pemeriksaan jaringan utuh yang diambil melalui biopsi atau operasi di bawah mikroskop. Pemeriksaan ini sering dibantu oleh penggunaan teknik pewarnaan khusus dan tes terkait lainnya, misalnya penggunaan antibodi untuk mengidentifikasi berbagai komponen jaringan pada tubuh. Histopatologi adalah salah satu pelayanan pemeriksaan laboratorium Patologi Anatomi dari sampel berupa jaringan operasi/biopsi, kerokan. Pemeriksaan ini berfungsi untuk melihat perubahan morfologi sel dari jaringan dengan metode paraffin. Pemeriksaan ini adalah gold standard untuk menentukan kelainan neoplasma atau non neoplasma serta menentukan terapi selanjutnya. Histologi amat berguna dalam mempelajari fungsi fisiologi sel-sel dalam tubuh, baik manusia, hewan, serta tumbuhan, dan dalam bentuk histopatologi ia berguna dalam penegakan diagnosis penyakit yang melibatkan perubahan fungsi fisiologi dan deformasi organ. Sebagai contoh, di bidang kedokteran, kehadiran tumor memerlukan hasil pemeriksaan contoh (sampel) jaringan. Di bidang pertanian, pemeriksaan kondisi jaringan pengangkut dapat mendukung diagnosis serangan hawar daun tembakau.

         Adapun prosedur untuk fiksasi jaringan adalah sebagai berikut : 

1.      Potong spesimen jaringan/organ dengan ukuran kurang lebih 4 mm

2.      Rendam dengan larutan fiksasi sesuai dengan tujuan pewarnaan atau komponen target

3.      Tunggu hingga tahap fiksasi selesai sempurna

4.       Cuci dengan air mengalir atau aquades (jika diperlukan)

5.       Lakukan tahap selanjutnya. 

       Mengingat target dari jaringan berbeda-beda seperti jenis sel yang ditemukan atau komponen lainnya (kimiawi atau imunologi) maka berikut ini akan dibahas tentang jenis-jenis larutan fiksasi untuk jaringan. 

1.         Formalin

               merupakan nama dagang dari suatu larutan yang mengandung 40% b/v (= 40% b/b) formaldehida (yang merupakan gas) di dalam air. Sebagian besar formaldehida hadir sebagai polimer larut, yang dipolimerisasi pada suatu larutan. Formalin mengandung sekitar 10% metanol, yang ditambahkan oleh produsen untuk menghambat pembentukan polimer yang lebih tinggi, yang menghasilkan suatu larutan yang biasa disebut dengan paraformaldehida. Formaldehida itu sendiri adalah senyawa yang bereaksi dengan protein dan ada pada konsentrasi yang sangat rendah yaitu 4% formaldehida dalam larutan. Struktur kimia formaldehida terlihat dalam Gambar x. 

 

Gambar 3 Struktur Kimia Formalin dan reaksinya dengan protein. 

       Larutan fiksatif yang paling umum digunakan untuk histopatologi adalah larutan 4% formaldehid yang biasa disebut dengan formalin 10%. Penggunaan larutan ini telah 50 tahun digunakan, hal ini dikarenakan larutan fiksatif dapat mempertahankan ph netral dan memiliki tekanan osmotik yang sama dengan cairan ekstraseluler. Untuk memastikan bahwa penggunaan formalin mencapai pH yang netral maka dilakukan dengan menambah garam sehingga disebut dengan netral buffered formalin, atau NBF. 

    Fiksasi sangat mempengaruhi hasil suatu pewarnaan sediaan histologik dan imunohistokimia. Seorang teknisi patlogi anatomi, patolog maupun peneliti harus dapat memutuskan metode yang paling tepat dalam hal fiksasi ini. Aspek yang perlu dipertimbangkan adalah suhu, ukuran wadah penyimpanan, rasio volume, konsentrasi garam buffer, ph dan waktu inkubasi. Fiksasi formalin biasanya dilakukan pada suhu kamar, menggunakan wadah spesimen rendah dan lebar untuk memungkinkan penetrasi yang optimal dan kemudahan dalam pengambilan spesimen oleh teknisi. Pilihan terbaik untuk rasio volume adalah 1:20, dan dimensi jaringan sebesar 3-4 mm. Untuk mencegah pembengkakan atau menyusut dari sel-sel maka larutan dibuat isotonik dengan ph 7,2-7,4 dianjurkan, dan juga untuk mempertahankan ultrastruktur sel serta meminimalkan distorsi sel. Semakin pendek waktu jeda pengambilan jaringan dari tubuh terhadap waktu perendaman dalam larutan fiksatif membuat hasil semakin baik. Waktu paparan fiksatifpun harus dioptimalkan untuk setiap jenis spesimen. Sebagai contoh, target dari glikogen di hati dapat dijadikan subjek dari artefak fiksasi. NBF akan menembus secara perlahan melalui membran hepatosit, dengan waktu penetrasi pada sel hepatosit ini glikogen yang berhubungan dengan matriks protein sitoplasma akan terpindahkan ke satu sisi dari sel. Hasil ini disebut sebagai polarisasi dan dianggap bagian dari morfologi ketika membedakan hasil dari pewarnaan (Gambar 4.8: polarisasi glikogen). Sediaan ini adalah contoh yang bagus untuk dijadikan kontrol dari spesimen yang telah lama direndam dalam larutan fiksatif yang mengandung formalin. Perubahan tersebut menunjukkan terjadi perubahan morfologi yang ekstrim 

Gambar 4.Sediaan histologik yang difiksasi dengan larutan formalin dan diwarnai dengan pewarna Periodic Acid Schiff. Terlihat posisi glikogen yang terpolarisasi di sisi sel yang berwarna magenta dengan inti ditengah berwarna biru.

2.          Larutan Bouin

     André Bouin (1870-1962) menemukan beberapa campuran fiksatif di tahun-tahun 1895-1900. Larutan Bouin sendiri berisi 10% formaldehida (25% formalin), asam asetat 0.9 M dan 0.04 M asam pikrat yang dilarutkan di dalam air. Asam pikrat menembus jaringan agak lambat, mengentalkan protein dan dapat menyebabkan beberapa penyusutan. Selain penggunaan asam pikrat akan menyebabkan jaringan menjadi berwarna kuning. Larutan Bouin ini memiliki pH berkisar 1,5 – 2. Penetrasi menggunakan larutan Bouin imi lebih cepat daripada penggunaan NBF. Efek komplementer dari ketiga komponen penyusun larutan Bouin ini bekerja baik untuk mempertahankan morfologi sel. Spesimen biasanya direndam dalam larutan Bouin selama 24 jam. Namun ketika penyimpanan terlalu lama di dalam campuran ini dapat menyebabkan hidrolisis dan hilangnya DNA dan RNA. Hal ini mengharuskan jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus dilakukan pencucian terlebih dahulu sebelum di proses lebih lanjut. Penggunaan larutan Bouin ini sangat cocok ketika sediaan hendak dilakukan pewarnaan menggunakan pewarnaan Trichrome. Pewarnaan Trichrome menggunakan kombinasi tiga pewarna dengan tambahan asam phosphotungstic atau phosphomolibdic sebagai bagian dari peningkatan warna sitoplasma, serat kolagen dan komponen lainnya dari jaringan.

        Adapun larutan-larutan yang sering digunakan sebagai larutan fiksasi adalah sebagai berikut :

a.    Netral Bufer Formalin 10%

1.        Aquades 900 ml

2.        Formalin (37% formaldehide) 100 ml

3.        Natrium diHidrogen Phospat

4.        (NaH2PO4) 4 gram

5.        DiNatrium Hidrogen Phospat

6.        Na2HPO4) 6.5 gram

Campurkan semua komponen menjadi satu, dan ukur hingga pH campuran sebesar 7.2 – 7,4. Ketika pH belum mencapai yang diharapkan maka tambahkan dengan perbandingan NaH2PO4 dan Na2HPO4 = 1:1,625 hingga pH sesuai, namun kita pH terlalu basa maka bisa ditambahkan dengan asam asetat sedikit demi sedikit hingga pH turun sesuai dengan yang diharapkan.

b.    Larutan Bouin

1.        Asam pikrat 2,1% dalam aquades 1500 ml

2.        Formalin (37% formaldehide) 500 ml

3.        Asam Asetat Glasial 100 ml

Efek dari penggunaan larutan fiksasi ini akan menghasilkan warna kuning. Warna kuning ini dapat dihilangkan dengan perendaman di alkohol 70%, lithium karbonat atau pewarna asam yang dibarengi atau secara terpisah pemberiannya ketika proses pewarnaan.

B.  Teknik Sediaan Sitologik

Sedangkan, sitopatologi adalah pemeriksaan sel tunggal atau kelompok sel kecil dari cairan atau jaringan di bawah mikroskop. Sederhananya, prosedur ini dilakukan dengan mengoleskan cairan sampel atau jaringan dari pengidap pada slide yang kemudian diperiksa di bawah mikroskop untuk melihat jumlah sel, jenisnya, dan bagaimana rinciannya. Sitopatologi umumnya digunakan sebagai alat skrining untuk mencari penyakit dan memutuskan apakah perlu dilakukan tes lanjutan. Contoh umum dari sitopatologi adalah pap smear, sputum, dan gastric washing.

Tes sitopatologi kadang-kadang disebut tes smear karena sampel dapat dioleskan pada slide mikroskop kaca untuk pewarnaan dan pemeriksaan mikroskopis selanjutnya. Namun, sampel sitologi dapat dibuat dengan cara lain, termasuk sitosentrifugasi. Jenis tes smear yang berbeda juga dapat digunakan untuk diagnosis kanker. Dalam pengertian ini, itu disebut smear sitologi .

Layaknya spesimen jaringan, spesimen sel pun harus melalui yang namanya fiksasi. Fiksasi spesimen sitologi yang sempurna adalah prasyarat untuk diagnosis sitologi dengan benar. Jika fiksasi jaringan seperti yang disebutkan pada topik di atas hanya dilakukan dengan tahap perendaman, berbeda dengan fiksasi pada sediaan sitologik terbagi menjadi beberapa bagian yaitu fiksasi kering, fiksasi lembab dan fiksasi basah. Pada jenis fiksasi basah, sediaan sitologik harus direndam dalam larutan fiksasi terpilih segera setelah pengambilan spesimen sitologi masih dalam kondisi yang lembab. Fiksasi spesimen sitologi yang dilakukan dengan segera dilakukan guna mencegah pengeringan dan perubahan bentuk sel akibat faktor luar. Hasil dari fiksasi tersebut akan memungkinkan pewarnaan menjadi jelas dan tentunya menghasilkan diagnosis yang benar. Lain halnya ketika fiksasi sitologi dilakukan dengan teknik pengeringan, metode ini dilakukan untuk sel-sel yang relatif kuat dari faktor lingkungan dan digunakan untuk jenis pewarnaan yang memiliki prinsip sederhana

Idealnya fiksasi yang dilakukan pada sediaan sitologik hampir sama kriteria dengan fiksasi yang dilakukan pada sediaan jaringan. Kriteria-kriteria yang harus diperhatikan dalam fiksasi sediaan sitologikadalah :

1.    Mempenetrasi sel dengan cepat

2.   Minimal menjaga sel dari kerusakan atau kehilangan komponen sel layaknya ketika sel masih dalam kondisi hidup.

3.    Menjaga secara struktur sel maupun komponen sel (kimiawi, enzimatik, imunologi)

4.    Menghentikan proses metabolisme autolisis

5.    Menghentikan pertumbuhan selular dan mikroorganisme.

6. Meningkatkan diferensiasi optik dan meningkatkan pewarnaan struktur dan komponen sel.

Seperti yang telah disebutkan di atas, fiksasi dari sediaan sitologik terbagi menjadi beberapa bagian yaitu :

1.    Fiksasi basah

Metode ini adalah metode yang ideal untuk menjaga suatu sediaan sitologik baik sitologi ginekologi ataupun sitologi non-ginekologi. Larutan fiksasi basah dapat terdiri dari :

a.    Alkohol 95-96%

b.    Methanol absolut.

c.    Eter: alkohol 95%

d.   Propanol dan isopropanol 80%

e.    Denaturasi alkohol

f.     Formalin Based

2.    Fiksasi “Coating“

Fiksatif Coating merupakan fiksasi yang dilakukan untuk pengganti fiksatif basah. Fiksasi ini dilakukan dengan memberikan aerosol (penyemprotan) pada spesimen sitologi yang dibuat secara konvensional maupun dengan metode berbasis cairan. Fiksasi ini terdiri dari alkohol dan polietilen glicol yang berfungsi sebagai pelapis dari sediaan sitologik menyemprotkan lapisan diaphine (Hairspray) dengan kandungan alkohol yang tinggi dan minimal lanolin atau minyak dapat juga menjadikannya fiksatif yang efektif.

3.    Fiksasi Kering

   Fiksasi kering merupakan fiksasi yang dilakukan pada sediaan sitologik yang dilakukan dengan mengeringkan sediaan tersebut di udara terbuka (udara kering) atau dengan bantuan pemanasan hingga kering (penggunaan hotplate dengan suhu maksimum 50OC). Sediaan sitologik harus diproses dan dikeringkan dengan segera untuk menghindari munculnya artefak. Salah satu keuntungan dari fiksasi ini adalah pembuatan dan pewarnaan yang cepat (2-3 menit). Pewarnaan cepat berguna dalam penilaian awal dari kelayakan spesimen sebelum pasien diperkenankan untuk meninggalkan ruang pengambilan spesimen. Untuk sediaanyang menargetkan koloid, mucin, butiran sitoplasma endokrin dan lain-lain akan lebih baik jika dilakukan fiksasi kering. Hal ini juga berguna pada pasien dengan indikasi keganasan hematologi seperti limfoma atau leukemia.

4.      Fiksasi Khusus

a.    Fiksasi Carnoy

          Fiksasi ini adalah fiksasi yang dikhususnya untuk spesimen yang hemoragik. Asam asetat dalam larutan fiksatif ini akan melisiskan sel darah merah. Fiksasi ini sangat baik untuk melihat detai dari inti serta pengawet untuk glikogen. Namun fiksasi ini akan menghasilkan penyusutan pada sel dan cenderung menghasilkan pewarnaan yang lebih di hematoxylin. Kelebihan waktu dalam fiksasi inipun akan menyebabkan kerusakan pada materi kromatin.

Adapun perbedaan dari fiksasi basah dan kering adalah sebagai berikut :

Tabel 4. Perbedaan Penggunaan Teknik Fiksasi Sitologik